本产品是基于探针法荧光定量PCR原理开发的高灵敏度检测试剂盒，具有以下特点：

产品特点

1. 即开即用，用户只需提供样品DNA模板，即可快速开展实验。

2. 引物及其组成经过优化，确保灵敏度高，可靠性强。

3. 试剂盒中提供阳性对照，有助于区别假阴性样品，提升检测准确性。

4. 特异性高，采用根据中间普雷沃菌DNA序列的高度保守区设计的引物，避免与其他生物样本的DNA发生交叉反应。

5. 可进行定性和定量检测，在线性范围内至少达到5个数量级。

6. 本产品支持50次20μL反应体系的探针法荧光定量PCR实验。

7. 本产品仅供科研使用。

使用方法

一、DNA提取

使用自选的方法提取和纯化样品DNA，确保与市场上大多数核酸提取试剂盒相兼容。

二、稀释标准曲线样品

因阳性对照浓度较高，建议在独立区域进行接下来的稀释操作，以避免样品和试剂盒其他成分的污染。

1. 标记六个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头加入45μL的DEPC-H2O。
3. 在7号管中加入5μL的阳性对照（1×10E8拷贝/μL），充分震荡1分钟，得到1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品，放入冰上待用。
4. 替换枪头，在6号管中加入5μL的从上步中稀释的阳性对照，震荡后得到1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品，放冰上待用。
5. 重复以上步骤，直到得到6个不同稀释度的标准曲线样品。如果无须制作标准曲线，将阳性对照稀释到1×10E5拷贝/μL即可。

三、试剂配制

根据待检样品数量，准备N+2个qPCR管，加入必要的试剂成分（详细说明可向尊龙凯时索取）并转移至样本准备区。

四、添加模板

在qPCR管中依次加入2μL模板，添加顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板、以及阳性对照，离心30秒后进行扩增反应。

五、扩增反应

将PCR管放入PCR扩增仪器的样品槽中，按照标准扩增程序进行。

六、结果分析

如果制作了标准曲线，以阳性对照浓度的log值为横轴，Ct值为纵轴绘制标准曲线，推算待测样品的DNA浓度。如果未制作标准曲线，则根据以下标准判定结果：

• 阳性对照： Ct值<30，明显指数增长，呈典型S型曲线。
• 阴性对照： Ct值38或无Ct值，无明显增长期和平台期。
• 样本检测结果： Ct值<35，表示样本中检测到婴儿利什曼虫，为阳性；Ct值38或无Ct值，表示未检测到，为阴性； Ct值在35-38范围需复检。

运输及保存

应低温运输，保存于-20℃，保存期限为一年。阳性对照须单独放置，以免污染其它试剂。